تقدير البروتين في الأغذية بطريقة كلداهل
الأساس العلمي :
تعتمد طريقة تقدير البروتين بطريقة كلداهل على تقدير النيتروجين في العينة ثم حساب نسبة البروتين عن طريق معامل ثابت لكل نوع من الاغذية وذلك خلال ثلاثة خطوات وهم كالتالي :
1- الهضم Digestion
في هذه الخطوة يتم تحويل النيتروجين العضوي الموجود في العينة (N) إلى نيتروجين معدني في صورة كبريتات الآمونيوم الهيدروجينية (NH4HSO4) باستخدام حامض الكبريتيك المركز وبعض العوامل المساعدة مثل كبريتات النحاس.
2- التقطير Distillation
تتم عملية التقطير باستخدام صودا كاوية مركزة (40 - 50 %) في وجود الحرارة وذلك لكسر كبريتات الامونيوم الهيدروجينية وتحرير الآمونيا (NH3) التي تتصاعد ليتم استقبالها في حامض مناسب.
3- المعايرة Titration
تتم المعايرة اما بطريقة مباشرة او بطريقة عكسية لحساب ملليمكافئات الآمونيا الناتجة من خطوة التقطير.
المعادلات التوضيحية لطريقة التقدير
أولا: خطوة الهضم والتي فيها يتحول النيتروجين العضوي الى كبريتات الامونيوم الهيدروجينية
ثانيا: خطوة التقطير باستخدام الصودا الكاوية المركزة والتي ينتج عنها الآمونيا (NH3)
يتم استقبال الامونيا الناتجة في حامض بطريقتين طريقة مباشرة وآخرى رجعية
الطريقة المباشرة : يتم استقبال الامونيا في حامض البوريك 4 % فيتحول جزء من حامض البرويك الى بورات آمونيوم يكافئ كمية الامونيا الناتجة من خطوة التقطير
يتم معايرة بورات الامونيوم المتكونة باستخدام حامض هيدروكلوريك 0.1 عياري لحساب ملليمكافئات بورات الامونيوم المتكونة ومنها يتم معرفة كمية الامونيا.
الدليل المستخدم في هذه الحالة هو دليل مختلط من أخضر برومو كريزول + أحمر الميثايل حيث يكون لونه قرمزي بمجرد وضعه مع حامض البوريك وأثناء عملية التقطير وتصاعد الامونيا وتكون بورات الامونيوم يتحول الدورق الى اللون الاخضر تدريجيا، ثم تتم عملية المعايرة بإرجاع لون الدورق من الاخضر الى اللون القرمزي مرة اخرى.
الطريقة الرجعية : يتم استقبال الامونيا في حامض هيدروكلوريك تركيزه 0.1 عياري وبالتالي يتكون مركب كلوريد الامونيوم مع ضمان وجود زيادة من حامض الهيدروكلوريك في الدورق أي لا يحدث تفاعل بين الامونيا وكل كمية الحامض في الدورق يجب ان يكون هناك زيادة من الحامض دائما.
خطوات التقدير
1. وزن العينة المجهزة المطحونة او المهروسة يكون في حدود (0.7-2.2) جرام.
2. إضافة العوامل المساعدة الكيميائية :
كبريتات النحاس CuSO4 يضاف منها 0.5 جرام لكل عينة أو أوكسيد زئبق يضاف منها 0.7 جرام او زئبق معدني يضاف منها 0.65 جرام.
كبريتات صوديوم او بوتاسيوم Na2SO4 او K2SO4 يضاف منها 15 جرام لكل عينة وغرضها رفع درجة غليان المخلوط ليصل الى 370 - 410 درجة مئوية وهي درجة الحرارة اللازمة لاتمام عملية الهضم.
كبريتات النحاس CuSO4 يضاف منها 0.5 جرام لكل عينة أو أوكسيد زئبق يضاف منها 0.7 جرام او زئبق معدني يضاف منها 0.65 جرام.
كبريتات صوديوم او بوتاسيوم Na2SO4 او K2SO4 يضاف منها 15 جرام لكل عينة وغرضها رفع درجة غليان المخلوط ليصل الى 370 - 410 درجة مئوية وهي درجة الحرارة اللازمة لاتمام عملية الهضم.
3. إضافة 25 مل من حامض الكبريتيك المركز 98% ويضاف بحرص على جدار زجاجة الهضم.
إذا تم استخدام وزن عينة أكبر من 2.2 يتم إضافة 10 مل حامض كبريتيك اضافية لكل 1 جرام مضافة.
4. تستمر عملية الهضم حتى تحول لون مخلوط الهضم إلى اللون اللبني او الوردي الشفاف وتستغرق هذه العملية قرابة 3 ساعات.
5. بعد تمام عملية الهضم يتم تبريد دورق الهضم ونقله كميا إلى دورق التقطير بإستخدام 200 مل من الماء المقطر ويراعى تبريد دورق التقطير تحت الماء لانه بوضع الماء المقطر على العينة المهضومة سوف يرفع درجة حرارة الدورق وبالتالي لا يصح اضافة الصودا الكاوية في هذه الحرارة العالية لان ذلك سوف يؤدي الى الفوران الشديد والارتفاع الكبير في درجة الحرارة.
6. يضاف 25 مل من محلول ثيوكبريتات الصوديوم لمعادلة الزئبق المضاف في حالة إضافة أوكسيد الزئبق أو الزئبق المعدني والرج جيدا.
7. تجهيز دورق يحتوي على 50 مل حامض بوريك 4% مع وضع 5 نقاط من الدليل المختلط.
او يتم الاستقبال في محلول حامض هيدروكلوريك 0.1 عياري في وجود دليل احمر الميثايل.
إضافة الصودا الكاوية المركزة بمعدل 15 جرام صودا كاوية لكل 10 مل حامض كبريتيك مستخدم للعينة
وبالتالي اذا تم تحضير صودا كاوية بتركيز 50 % فيستخدم منها 30 مل لكل 10 مل حامض كبريتيك مستخدم
8. التقطير مع التسخين حتى وصول الحجم في دورق الاستقبال إلى 150 مل.
9. في حالة الاستقبال في حامض بوريك تتم معايرة محتويات الدورق باستخدام حامض هيدروكلوريك 0.1 عياري حتى الوصول للون القرمزي وتسجل قراءة السحاحة.
أما في حالة الاستقبال في حامض هيدروكلوريك تركيزه 0.1 عياري يتم المعايرة باستخدام صودا كاوية تركيزها 0.1 عياري حتى الوصول للون الاحمر الوردي المائل للبرتقالي او الاصفر
تركيب وحدات الهضم والتقطير
أولا : وحدة الهضم : وهي عبارة عن سخان كهربائي او مصدر حرارة للزجاجات التي تحتوي مكونات الهضم ويراعى ان تكون زجاجات الهضم متحملة للحرارة العالية ويراعى بعد انتهاء الهضم مباشرة عدم وضع الزجاجات وهي ساخنة تحت الماء لتبريدها حيث ان الصدمة الحرارية قد تؤدي الى كسر دورق الهضم
يراعى وجود مصيدة غازات فوق وحدة الهضم حيث ان الابخرة المتصاعدة هي ابخرة حامض الكبريتيك السامة والخطرة على الجهاز التنفسي
ثانيا : وحدة التقطير : وتتكون من دورق التقطير ومصدر تسخين ومصيدة كلداهل Kjeldahl's trap وعلى الجانب الاخر مكثف ثم دورق الاستقبال
يجب ان تكون الوحدة مغلقة جيدا سواء عند التقاء دورق التقطير بالسدادة او مصيدة كلداهل لاجبار الامونيا مع الضغط العالي الناشئ عن درجة حرارة التسخين الى الصعود والدخول في المكثف والنزول في دورق الاستقبال
يراعى ان يكون اللهب مناسبا وقوي وعدم اطفاء اللهب الا بعد اتمام عملية التقطير وازالة دورق الاستقبال لسبب مهم وهو ان التسخين يتسبب في حدوث ضغط عالي في دورق التقطير وبالتالي باغلاق اللهب سوف يحدث العكس ويكون هناك تفريغ فيقوم هذا التفريغ بعمل معادلة عن طريق سحب الحامض الموجود في دورق الاستقبال الى دورق التقطير وبالتالي تفشل التجربة
يراعى ان يكون معدل دخول الماء الى المكثف جيد ومناسب وللعلم فان عملية التقطير تحتاج الى معدل دخول سريع للماء لضمان كفاءة عملية تبريد غازات الامونيا المتصاعدة من عملية التقطير
أولا : الطريقة المباشرة (الاستقبال في حامض بوريك)
ملليمكافئات النيتروجين = ملليمكافئات الامونيا = ملليمكافئات بورات الامونيوم المتكونة = ملليمكافئات حامض الهيدروكلوريك اللازم للمعادلة
وبالتالي تصبح
ملليمكافئات النيتروجين = ملليمكافئات حامض الهيدروكلوريك اللازم للمعادلة
ح = حجم السحاحة المستهلك من حامض الهيدروكلوريك اثناء المعايرة.
ع = عيارية الهيدروكلوريك والتي تكون في حدود 0.1 عياري
14.007 = الوزن المكافئ للنيتروجين
ملحوظة هامة : عند عمل تجربة بلانك تكون ح = (حجم السحاحة في التجربة - حجم السحاحة في البلانك)
ثانيا : الطريقة الرجعية (الاستقبال في حامض الهيدروكلوريك تركيزه 0.1 عياري).
ملليمكافئات النيتروجين = ملليمكافئات الامونيا = (المليمكافئات الكلية للحامض - ملليمكافئات الصودا الكاوية في المعايرة).
يراعى هنا ان الامونيا تفاعلت مع جزء من حامض الهيدروكلوريك وما يتم معايرته بالقلوي هو الجزء المتبقي والذي لم يتفاعل مع الامونيا وبالتالي لحساب الجزء التي تفاعل مع الامونيا يتم حسابه بطريقة رجعية
الكل = المتفاعل مع الامونيا + المتبقي (المعاير بالصودا)
وبالتالي المتفاعل مع الامونيا = الكل - المتبقي (المعاير بالصودا)
وعليه تكون ملليمكافئات النيتروجين = ملليمكافئات الهيدروكلوريك التي تفاعلت مع الامونيا = (الملليمكافئات الكلية للهيدروكلوريك - ملليمكافئات الصودا الكاوية اللازمة للمعايرة)
حيث ان:
(حxع) HCl = الحجم الكلي المستخدم في الاستقال (50 مل) وعيارية الهيدروكلوريك (0.1 عياري).
(حxع) NaOH = حجم السحاحة المستهلك في معادلة المتبقي من الهيدروكلوريك وعيارية الصودا الكاوية (0.1 عياري).
14.007 = الوزن المكافئ للنيتروجين
تحويل نسبة النيتروجين الى نسبة بروتين
يوضح الجدول التالي نسبة النيتروجين في بروتين بعض الاغذية وكذلك عامل التحويل المستخدم في كل نوع غذاء
أمثلة على الحسابات :
1. عند تقدير نسبة البروتين في عينة لحوم، أخذ وزن عينة 1.121 جرام وتم اجراء عملية الهضم والتقطير وتم استقبال الامونيا الناتجة في 50 مل حامض بوريك 4%، ثم المعايرة بحامض هيدروكلوريك تركيزه 0.098 عياري حيث كانت قراءة السحاحة 14.2 مل. إحسب % للبروتين في العينة.
تم استخدام الطريقة المباشرة
% للنيتروجين = 1.7 %
% للبروتين = 1.7 * 6.25 = 10.6%
2. في تقدير نسبة البروتين في عينة قمح باستخدام 1 جرام عينة تم اجراء عملية الهضم والتقطير وتم الاستقابل في 50 مل حامض هيدروكلوريك تركيزه 0.1 عياري ومعايرة المتبقي من الهيدروكلوريك بصودا كاوية تركيزها 0.1 عياري حيث كانت قراءة السحاحة 44 مل. إحسب % للبروتين في العينة.
% للنيتروجين = 0.84 %
% للبروتين = 0.84 * 5.33 = 4.48 %
فيديو توضيحي لتقدير البروتين والحسابات
فيديو توضيحي لتقدير البروتين والحسابات
المراجع
